01 产品概述

X-Flash WB All-in-One Kit用于检测特定蛋白质表达丰度,流程包括蛋白提取、电泳分离、转膜、抗原活化与激活、洗膜、ECL显色及膜再利用(选配)等步骤。以下为各步骤的基本操作及所需试剂总览。

02 产品

03-1 蛋白提取

1. 裂解操作:

贴壁细胞

1. 去除培养液,用PBS漂洗,无需胰酶和细胞刮板。(其他容器推荐裂解液用量说明见本手册最后一页。)
2. 每1×10⁶个细胞,加入200 μL X-RIPA UltraMix预混裂解液。
3. 4°C冰浴静置15 min,用移液器吹打混匀后,转移到离心管中。

悬浮细胞

细菌或酵母

1. 离心收集细胞,用1×PBS重悬、清洗,弃去PBS。
2. 每1×10⁶个细胞,加入200 μL X-RIPA UltraMix预混裂解液,吹打混匀。
3. 冰浴或4°C静置15min。
4. 实验中,细菌样本需添加溶菌酶,酵母样本需添加蜗牛酶。

组织样品

1. 用生理盐水漂洗新鲜组织,切块后吸干。
2. 每20 mg组织加入200 μL X-RIPA UltraMix预裂解液,冰浴匀浆1-2min。(特殊组织样品肠道组织,肝脏组织,脂肪组织,联系工作人员获得去油脂方案。)

2. 离心取上清:

12000-14000g 冷冻离心 3-5 min,取上清-80℃保存或立马变性;若样本仍含透明状粘稠物,加倍添加裂解液,反复吹打再次离心后取上清使用。

3. 样品变性:

将上清与 X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液以 4:1(5X)比例在室温下混匀,95-100℃加热 5 min 变性,加热结束后瞬时离心,取样加入到 SDS-PAGE 胶加样孔内。(膜蛋白联系工作人员获得更优变性方案)

03-2 电泳

1. 缓冲液配制:取 20 mL X-R&T Buffer(50X),用 dd 水定容至 1 L; 若配制后出现白色浑浊,说明水质重金属离子超标,建议更换纯净水或娃哈哈水。
2. 预制胶安装:取出 X-Gel PreCast 预制胶,撕掉底端棕色保护条,(在水龙头下拔梳子,双手指腹位于梳齿两侧,慢慢向上平稳的平行推出后,甩掉里面多余液体,透光观察样品孔状态,如有歪斜,用长枪头拨正即可,联系工作人员可查看详细视频)。将加样孔一面朝内槽安装到电泳槽中,确保内、外槽电泳液面一致且超过加样孔位置;若外槽液面不足,可添加填充物或按比例稀释更多电泳液。
3. 上样与电泳:预留一到两个样品孔加入 2-3 μL 三色预染蛋白 Marker(用新枪头吸取,避免沾染电泳缓冲液污染),其余样品孔直接上样(避免枪头过度插入胶板)。恒压 300 V 电泳 15 min 或 250 V 电泳 20 min,Marker 分离达到理想状态即可停止电泳,无需依赖溴酚蓝位置。
4. 凝胶取出:电泳结束后用配套翘板工具(禁止使用普通切胶板)插入胶板两侧铆钉,自上而下依次撬动胶板,最底端的铆钉无法撬开属于正常现象,直接用力掰开,直接把胶扣到已经充分浸润的三明治滤纸上,凝胶即可自动脱落。(可联系工作人员查看详细视频)

03-3 转膜（免冰浴转膜）

1. 膜的准备:X-即用 NC 膜(强烈推荐,效果优于传统的PVDF膜)直接浸入提前制备的转膜缓冲液中平衡,弃去保护纸;X-即用 PVDF 膜需先在无水乙醇/甲醇中充分浸润 30s 以上激活,浸入转膜缓冲液平衡,操作时避免剧烈摩擦膜表面。
2. 转膜缓冲液配制:
   • 方法一:电泳液800 mL+无水乙醇200 mL。
   • 方法二: X-R&T Buffer(50X)16 mL+无水乙醇200 mL+dd水定容到1 L。
3. 三明治组装:按 “黑色夹板(负极) – 海绵 – 滤纸 3 张 – 凝胶 – 膜 – 滤纸 3 张 – 海绵 – 透明或红色夹板(正极)” 顺序组装,完全排出气泡,夹紧后放入湿转电转槽;避免使用变形夹板,确保使用试剂盒配套海绵和滤纸。(若进行了凝胶裁切需裁切膜的尺寸小于凝胶尺寸)
   • 2块胶转膜系统,严格按照试剂盒提供的 1片海绵+3张滤纸。
   • 4块胶转膜系统,严格按照试剂盒提供的 1片海绵+2张滤纸。
4. 转膜条件:10–180 kDa 的蛋白推荐 400 mA 转膜 15 min;超过 200 kDa 的蛋白推荐 400 mA 转膜 20–25 min;若蛋白分子量小于 20 kDa,建议使用 X-即用 NC 膜。

03-4 转膜质检

本试剂盒不含蛋白染色液和立春红染色液,需额外采购

转膜后小心取出凝胶,放入 20 mL X-UltraStain 蛋白染色液中摇床染色 15 min观察是否有蛋白残留,或用 10-20 mL 免洗丽春红染色液对膜进行染色 1-2 min,倒掉染色液后用蒸馏水漂洗 2-3 次,直至出现清晰条带,拍照记录转膜效率。

03-5 内参检测

此流程只针对内参抗体,转膜后,就无需内参一抗二抗孵育,无须封闭。如无需内参检测就按照常规流程进行下一步。

1. 染色液预混准备:将 Actin孵育加速液瞬时离心后,按照加速液1μL 、Actin 染色液1mL 比例,现配现用,轻摇混匀,不要斡旋混匀。
2. Actin染色孵育:转膜完成后,将膜直接置入混合好的染色液中(2-5 mL),室温摇床染色 10–15 min。
3. 膜漂洗:取 TBST (搭配X-高效漂洗液效果更佳),将膜转入TBST中,摇床漂洗 5分钟 × 3 次。
4. 显色曝光:将膜双面充分浸润显影液,进行曝光显色。

03-6 抗原激活与抗体孵育

过程原理

X-Ag&Ab SpeciBind可充分激活膜上抗原(Ag),使其暴露出更多的抗体识别位点;同时还能激活抗体(Ab),稳定其抗原结合位点的空间构象,提升抗原-抗体的结合速率。

由于本品不含可能导致抗原-抗体发生非特异性桥连聚合的大分子蛋白成分,能够有效去除抗原和抗体表面的潜在非特异结合位点,减少非特异性吸附。

抗原激活,一抗活化与孵育,漂洗,所有操作过程需保证:先倒溶液至孵育盒中,再把膜浸入溶液;避免多张膜在一个孵育盒中,确保膜的正面朝上。

1. 抗原位点激活:向干净的孵育盒 A 中加入 5–10 mL X-Ag&Ab SpeciBind(以让膜自然漂浮为准),浸入转印后的PVDF/NC膜,膜正面朝上。室温摇床80 rpm激活 1min。(当蛋白丰度较低时,建议弃去溶液,重新加入X-Ag&Ab SpeciBind进行二次平衡/激活1 min)
2. 一抗活化与孵育(方案二选一)
   • 方案一:直接向孵育盒 A 中加入一抗原液,使其终浓度达到抗体说明书的推荐比例。(若孵育盒A中液体总体积为 10 mL,抗体推荐稀释比例为 1:1000,可直接加入 10 μL 抗体原液。)
   • 方案二:根据抗体说明书推荐比例,先用 X-Ag&Ab SpeciBind 预先稀释制备一抗工作液,倒入干净的孵育盒 B 中(以让膜漂浮为准),将激活后的膜转移至孵育盒B 中（膜正面朝上）。室温摇床50 rpm孵育 1~2 h,(也可以 4°C 摇床过夜孵育)。孵育结束后,一抗工作液可回收,4°C 可保存 3 个月,-20°C 可保存半年以上。
3. 漂洗:用高效漂洗液(50x浓缩液,用前稀释)5–10 mL,摇床80 rpm漂洗 5 min × 3 次。体积以让膜漂浮为准,保持膜的正面朝上。
4. 二抗活化与孵育:先用 X-Ag&Ab SpeciBind 预先稀释二抗,再将稀释后的溶液倒入干净的孵育盒 C 中。(以让膜漂浮为准),直接将漂洗后的膜移至孵育盒 C 中(膜正面朝上)。室温摇床80 rpm孵育 1 h。(建议加倍稀释二抗,若二抗说明书推荐稀释比例为1:10000;则按照1:20000稀释)
5. 重复漂洗:重复步骤 4,漂洗三次。

03-7 ECL 显色

1. 配置发光液:按等体积将 A 液与 B 液混合,现配现用;混合后的发光液直接倒入孵育盒中。
2. 放入膜并均匀覆盖:将吸干表面水分的膜放入已加好发光液的孵育盒内,轻轻摇动,使发光液充分、均匀覆盖整张膜。
3. 曝光检测:将膜转移至曝光保护膜中,放入化学发光仪进行曝光;若信号过强,可适当降低抗体浓度或减少上样量。

03-8 膜再利用(Stripping)

本试剂盒不含剥离液,需额外采购

1. 漂洗:将曝光后的膜放入容器中,加入 20 mL 去离子水(禁止使用 TBST),室温摇床漂洗 5 min。
2. 剥离:弃去去离子水,加入 X-Strip 高效剥离液完全覆盖膜,室温摇床剥离 10 min;若蛋白表达量较高,可重复 1 次剥离步骤。
3. 二次漂洗:再次加入 20 mL 去离子水,室温摇床漂洗 5 min。 然后,重复前面03-6抗原活化与激活操作。

不同细胞量裂解液用量

按对应比例加入 X-RIPA UltraMix 预混裂解液