01 产品概述

Western Blot(WB)是一种常用于检测特定蛋白质表达的实验技术,流程包括蛋白提取､电泳分离､转膜､封闭､抗体孵育､洗膜､ECL显色及膜再利用(Stripping) 等步骤｡以下为各步骤的基本操作及所需试剂总览｡

02 产品清单

产品名称 规格
X-RIPA UltraMix预混裂解液 5mL
X-Loading还原型蛋白上样缓冲液 2mL(5X)
X-Gel PreCast预制胶套装 10PE+100mL(50X)
三明治套餐 滤纸12张+海绵4片
内参染色液 10mL
X-高效漂洗液 10mL
X-ECL超敏发光液(fg) 10mL

03 WB实验操作步骤及注意事项

03-1 蛋白提取

推荐裂解液体积（艾克裂解液）

培养容器 细胞量 推荐裂解液体积
6孔板(单孔) 1×10⁶ 200μL
12孔板(单孔) 0.5×10⁶ 100μL
24孔板(单孔) 0.2~0.3×10⁶ 50μL
60mm培养皿 2~3×10⁶ 400–500μL
100mm培养皿 8~10×10⁶ 1mL
T25瓶 2~3×10⁶ 400–500μL
T75瓶 8~10×10⁶ 1mL

X-RIPA UltraMix预混裂解液使用流程

贴壁细胞
  1. 去除培养液,用PBS漂洗,无需胰酶和细胞刮板｡
  2. 每100w个细胞,加入100-200μL X-RIPA UltraMix预混裂解液｡
  3. 4°C冰浴静置15min,用移液器吹打混匀后,转移到离心管中｡
  4. 10000-14000g冷冻离心3-5min,取上清进行后续实验｡
悬浮细胞/细菌/酵母
  1. 离心收集细胞,用1×PBS重悬､清洗,弃去PBS｡
  2. 每100w个细胞,加入100-200μL X-RIPA UltraMix预混裂解液,吹打混匀｡
  3. 冰浴或4℃静置15min｡
  4. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5min,取上清进行后续实验｡
  5. 实验中,细菌样本需添加溶菌酶,酵母样本需添加蜗牛酶｡
组织样品
  1. 用生理盐水漂洗新鲜组织,切块后吸干｡
  2. 每20 mg组织加入100-200μL X-RIPA UltraMix预裂解液,冰浴匀浆1-2min｡
  3. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5min,取上清进行后续实验｡
注意事项：
  1. 可反复冻融,不影响实验效果;样品不适合Bradford法,推荐BCA法检测蛋白浓度｡
  2. 若样本仍含粘稠物,加倍添加裂解液,离心后取上清使用｡

X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液使用流程

  1. 在室温下将本品与待检测样品以1:4(5X)混匀｡
  2. 95°C-100°C变性5 min｡
  3. 加热结束后瞬时离心,取样加入到SDS-PAGE胶加样孔内即可｡
注意事项：
  1. 本品含有变性剂及还原剂,不适用于Native PAGE胶的电泳｡
  2. 与样品混合加热后,管盖上出现较多冷凝水,建议瞬离｡
  3. 常温存放即可,如低温运输中发生凝固,可37℃水浴加热5分钟即可恢复丝滑｡

03-2 电泳

X-Gel PreCast预制胶 / X-R&T Buffer通用缓冲液50X使用流程

  1. 取20mL X-R&T Buffer(50X),用dd水定容至1L｡
  2. 从包装中取出预制胶,撕掉底端棕色保护条｡
  3. 将预制胶安装到电泳槽中,确保电泳槽内外槽电泳液面一致,并且超过加样孔位置｡
  4. 恒压300V,15Min ,或者250V,20Min｡
注意事项：
  1. 内外槽的液面高度务必保持一致,并超过加样孔上端｡
  2. 电泳结束的判断不依赖于溴酚蓝的位置,只要Marker 分布情况达到理想状态,即可停止电泳｡
  3. 若按照说明书稀释的电泳液,无法使外槽液面高度与内槽一致,可以在外槽加入一些填充物,或者按比例稀释更多的电泳液｡
  4. 电泳结束后,打开预制胶,务必使用配套的翘板工具不能使用普通的切胶板｡

三色预染蛋白Marker使用流程

  1. 使用新的枪头吸取蛋白Marker,不可使用沾染电泳缓冲液的枪头直接吸取本品,防止污染,每次使用量,单孔2-3μL｡
  2. 使用结束,盖上管盖,放回-20℃储存,防止蛋白Marker降解｡

03-3 转膜（免冰浴转膜）

X-即用NC膜使用流程

  1. 使用X-NC膜前,确保膜的保存和包装完好无破损,无污染痕迹｡
  2. 打开膜的包装,用镊子取出单张的X-即用NC膜,浸入到提前制备好的转膜缓冲液中,弃去膜两侧的保护纸｡
  3. 按照标准的Western Blot实验操作流程进行转膜操作｡
注意事项：
  1. 操作时避免对膜造成剧烈摩擦,避免膜的表面被污染或破损｡
  2. 确保转膜缓冲液､封闭液､抗体等试剂的pH和浓度适合膜的性能｡
  3. 避免转膜､封闭､抗体孵育过程中的膜干燥｡

X-即用PVDF膜使用流程

  1. 在使用即用PVDF膜之前,确认膜的保存状态和包装完好无污染｡
  2. 用镊子将即用PVDF膜从包装中取出,放入无水乙醇､甲醇中充分浸润,去除外层保护纸,激活30s以上备用｡
  3. 按照标准Western Blot实验流程,进行转膜操作｡
注意事项：
  1. 操作时避免手指或其他物品直接接触膜表面,以免造成污染或损伤｡
  2. 避免转膜､封闭､抗体孵育等操作中膜干燥｡
  3. 膜的保存过程中避免弯折,避免与锐利物品的接触｡

X-R&T Buffer通用缓冲液50X（转膜液制备）

制备方法 配比详情
方法一 电泳液800mL
方法二 浓缩液16mL + （按实验需求补充溶剂）

转膜方案对比

转膜稳定高效方案 普通方案
X-Transfer Pro 三明治套件 三明治夹板+海绵+滤纸
请注意:避免使用变形的三明治夹板,确保海绵具有良好弹性, 并选用适当厚度的滤纸,避免过厚影响效果｡ \*详细三明治制作细节, 请联系工作人员,索要教程

X-高效漂洗液使用流程

  1. 取X-高效漂洗液50X 20 mL,用dd水定容至1L,将膜从抗体中取出,用漂洗工作液轻轻冲去多余的液体｡
  2. 将膜放入漂洗工作液中,确保漂洗剂完全覆盖膜表面,建议摇床漂洗1次,每次1分钟,摇床速度80rpm｡
  3. 完成漂洗后,取出膜,轻轻吸干多余的漂洗液,继续下一步实验｡
注意事项：
  1. 按照推荐浓度稀释,避免过浓或过稀的漂洗剂影响实验结果;
  2. 摇床漂洗之前,确保对膜的两面,用漂洗液进行了一次冲洗｡

03-4 转膜质检

X-UltraStain蛋白染色液

主要作用
  • 快速考染调整内参：电泳后直接染胶,根据蛋白条带分布,精准调整内参和样本量｡
  • 质检转膜效率：评估转膜效率,优化电压､时间等转膜条件｡
使用流程
  1. 取出电泳槽中的凝胶,放到染胶容器中｡
  2. 加入X-UltraStain蛋白染色液 (约30-50 mL) 覆盖凝胶,在摇床上染色2-20min即可完成染色｡
  3. (友情提醒:染液可以重复利用3次,随着次数的增加,染色速度略微下降,但不影响灵敏度｡)
  4. 将染出条带的凝胶放水中保存即可,拍照;也可以在染液中继续存放,背景也不会加深｡
注意事项：
  1. 本产品用于专业人员的科学研究,不得用于临床诊断､治疗､食品或药品｡
  2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作｡
  3. 胶在染液之前用纯水漂洗1分钟,使用后染色液可在室温下储存,但建议在每次使用前轻微混匀｡
  4. 不同的样品类型和蛋白浓度可能需要不同的染色时间建议观察染色过程,直到蛋白条带清晰可见｡
  5. 确保凝胶或膜在染色液中完全浸泡,避免染色不均匀｡
  6. 染色灵敏度一般可达到10ng｡

免洗丽春红染色液使用流程

  1. 将转印结束后的PVDF膜或硝酸纤维素膜(NC膜),放在一个干净的孵育盒中｡
  2. 注意:不要使用接触过抗体的孵育盒;
  3. 建议加入10-20 mL染色液,于脱色摇床上染色1-2分钟,倒掉染色液加入蒸馏水,PBS或其它适当溶液漂洗2-3次,直到出现清晰条带,拍照记录结果｡
  4. 若使用本公司的快速封闭液(X-Blocking低背景快速封闭-Xblot-004)无需洗脱丽春红条带,可直接封闭,进行后续的WB检测｡
注意事项：
  1. 本产品用于专业人员的科学研究,不得用于临床诊断､治疗､食品或药品｡
  2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作｡

03-5 内参染色

极速内参染色液使用流程

  1. 染色液预混准备:将 Actin(Tubulin/GAPDH)孵育加速液 10 μL 加入 Actin 染色液 10 mL 中,混匀后 置于 4°C 保存备用｡
  2. Actin(Tubulin/GAPDH)染色孵育:转膜完成后,将膜直接置入混合好的染色液中(2-5mL),室温摇床染色 10–15 分钟｡
  3. 膜漂洗:取 TBST (搭配X-高效漂洗液效果更佳),将膜转入TBST中,摇床漂洗 5分钟 × 3 次｡
  4. 显色曝光:将膜双面充分浸润显影液,进行曝光显色｡
注意事项：
  1. 使用平头镊取放NC/PVDF膜时,轻夹膜边角,避免表面划痕或压痕｡
  2. 内参染色液可反复使用3-5次,使用后及时放回4℃保存｡
  3. 操作全程请勿将膜直接与孵育盒接触,避免污染膜背面｡

03-6 漂洗

X-高效漂洗液使用流程

  1. 取X-高效漂洗液50X 20 mL,用dd水定容至1L,将膜从抗体中取出,用漂洗工作液轻轻冲去多余的液体｡
  2. 将膜放入漂洗工作液中,确保漂洗剂完全覆盖膜表面,建议摇床漂洗 3 次,每次5 分钟,摇床速度80rpm｡
  3. 完成漂洗后,取出膜,轻轻吸干多余的漂洗液,继续下一步实验｡
注意事项：
  1. 按照推荐浓度稀释,避免过浓或过稀的漂洗剂影响实验结果;
  2. 摇床漂洗之前,确保对膜的两面,用漂洗液进行了一次冲洗｡

03-7 ECL显色

X-ECL超敏发光液(pg/fg)使用流程

  1. 混合等体积的超敏ECL发光液A和B,现配现用｡
  2. 将待检测的膜进行TBST漂洗,5分钟1次,共3次｡
  3. 每10 cm平方膜加1mL工作液,均匀覆盖膜,立即进行压片或荧光成像仪检测｡
  4. 使用X-Strip高效剥离液(Xblot-0015N/P),同一张膜可反复进行20次个上的指标检测｡
注意事项：
  1. 务必使用不同的吸头分别吸取A液和B液,避免交叉污染｡
  2. 避免强光照射,使用后立即密封保存,以免灵敏度降低,A､B液中偶有絮状物沉淀,属于稳定剂析出,不影响发光性能｡

曝光保护膜使用流程

  1. 清洁实验台面和所有必要的设备,确保工作环境无污染｡
  2. 打开后将NC膜/PVDF膜放入曝光保护膜中,滴入ECL发光液后将其合上,整体转移至化学发光仪载物台上,开启曝光程序｡
注意事项：
  1. 使用前,确保保护膜没有过期或损坏,请勿用尖锐物品或过多压力接触膜保护膜,以免造成破损,不建议反复重复使用｡

显色结束｡如需重复检测,请自行准备剥离液进行下一步操作｡(本试剂盒不含剥离液)

03-8 Stripping（膜再利用）

X-Strip高效剥离液(NC/PVDF膜)使用流程

  1. 将PVDF膜或NC膜放入容器中,加入20 mL去离子水(请勿使用TBST),室温下摇床漂洗5分钟｡
  2. 丢弃去离子水,加入剥离液,完全覆盖膜,室温下摇床剥离10分钟｡
  3. 丢弃剥离液,再次加入去离子水(请勿使用TBST),室温下摇床漂洗5分钟,若蛋白表达量较高,可重复1次(步骤2-3)｡
  4. 封闭与孵育:若使用艾克生命Xblot-004封闭液,则无需再次封闭可直接进行一抗二抗孵育;若使用其他封闭液,需重复封闭步骤｡
  5. 每张膜请单独操作以避免交叉污染｡
注意事项：
  1. 如果剥离之前,膜上面有棕色条带形状,是因为蛋白表达量过高以及ECL发光液的发光反应过度异常导致的,建议更换成无痕ECL或降低上样量､调整曝光顺序｡
  2. 建议优先孵育曝光丰度较低的蛋白,剥离之后,再孵育丰度较高的蛋白｡
  3. 洗脱效果可能受到膜类型､抗体类型､抗体浓度及抗原特性的影响,调整操作时请根据实际情况优化｡

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官方网站:www.Xblot.cn

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