01 产品概述

X-Flash WB All-in-One Kit用于检测特定蛋白质表达丰度,流程包括蛋白提取、电泳分离、转膜、抗原活化与激活、洗膜、ECL显色及膜再利用(选配)等步骤。以下为各步骤的基本操作及所需试剂总览。

02 产品清单

产品名称 规格 储存温度
X-RIPA UltraMix预混裂解液 5 mL -20℃
X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液 2 mL(5X) 常温储存
X-Gel PreCast预制胶 10 PE 常温储存
X-R&T Buffer电泳/转膜通用缓冲液 100 mL(50X) 常温储存
三明治套餐 滤纸12张+海绵4片 常温储存
内参/标签染色液 10 mL -20℃
X-高效漂洗液 10 mL 常温储存
X-ECL超敏发光液(fg) 10 mL 常温储存

03 WB实验操作步骤及注意事项（1小时版）

03-1 蛋白提取

裂解操作

贴壁细胞
  1. 去除培养液,用 PBS 轻柔润洗 2 次,(贴壁不牢固的细胞,PBS 需缓慢沿壁滴入,避免冲掉细胞)。
  2. 单个6孔板约1×10⁶个细胞,加入 200 μL X-RIPA UltraMix,(其他培养容器用量参照说明书最后一页)。
  3. 轻轻摇晃约 10 s,快速反复吹打后转移至洁净 EP 管,4 ℃ 冰浴静置 15 min, 期间可用移液器吹打 2 次。(贴壁较牢固的细胞可配合使用细胞刮板)。
悬浮细胞、细菌或酵母
  1. 离心收集细胞,用1×PBS重悬、清洗,弃去PBS。
  2. 每1×10⁶个细胞,加入200 μL X-RIPA UltraMix预混裂解液,吹打混匀。
  3. 冰浴或4°C静置15min。
  4. 实验中,细菌样本需添加溶菌酶,酵母样本需添加蜗牛酶。
组织样品
  1. 用预冷生理盐水将切碎的组织漂洗 2–3 次,用洁净吸水纸吸干多余液体。
  2. 按每 20 mg 组织加入 200 μL X-RIPA UltraMix 预裂解液,采用钢珠研磨 3–5 min,随后冰上静置 10 min。(特殊组织样品肠道组织,肝脏组织,脂肪组织,联系工作人员获得去油脂方案。)

离心取上清

12000-14000g 冷冻离心 3-5 min,取上清-80℃保存或立马变性;若样本仍含透明状粘稠物,加倍添加裂解液,反复吹打再次离心后取上清使用。

样品变性

将上清与 X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液以 4:1(5X)比例在室温下混匀,95-100℃加热 5 min 变性,加热结束后瞬时离心,取样加入到 SDS-PAGE 胶加样孔内。(膜蛋白联系工作人员获得更优变性方案)

注意事项：
  1. 本品裂解变性后样品可反复冻融,不适合 Bradford 法,推荐采用 BCA 法检测蛋白浓度,进行 BCA 定量时,需使用本裂解液稀释 BSA 以制备标准曲线的拟定。
  2. X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液含变性剂及还原剂,不适用于 Native PAGE 胶的电泳。
  3. 样品混合加热后管盖会出现较多冷凝水,务必瞬时离心。
  4. X-loading常温存放即可,低温运输中凝固可 37℃水浴加热 5 min恢复,若仍有粘稠物,可剪去枪头尖端吸取。

03-2 电泳

  1. 缓冲液配制:取 20 mL X-R&T Buffer(50X),用 dd 水定容至 1 L;若配制后出现白色浑浊,建议更换超纯水或娃哈哈水。
  2. 预制胶安装:取出 X-Gel PreCast 预制胶,撕掉底端棕色保护条→从两侧平行推出梳子→透光检查样品孔(若歪斜用枪头拨正)→加样孔朝内安装到电泳槽,确保内、外液面一致且没过加样孔,外槽液体不足则加填充物 / 补配缓冲液。(详细操作联系工作人员看视频)
  3. 上样与电泳:预留一到两个样品孔加入 2-3 μL 三色预染蛋白 Marker(用新枪头吸取,避免沾染电泳缓冲液污染),其余样品孔直接上样(避免枪头过度插入胶板)。恒压 300 V 电泳 15 min 或 250 V 电泳 20 min,Marker 分离达到理想状态即可停止电泳,无需依赖溴酚蓝位置。
  4. 凝胶取出:用配套翘板工具,自上而下撬胶板两侧铆钉(禁止用普通切胶板),底端铆钉若撬不开可直接掰断→胶扣到浸润的三明治滤纸上可自动脱落。(详细操作联系工作人员看视频)
注意事项：
  1. 三色预染蛋白 Marker 使用后需盖上管盖,放回 -20℃储存,防止降解。
  2. 电泳全程确保电泳槽水平放置。

03-3 转膜（免冰浴转膜）

  1. 膜的准备:X-即用 NC 膜(强烈推荐,效果优于传统的PVDF膜)直接浸入提前制备的转膜缓冲液中平衡,弃去保护纸;X-即用 PVDF 膜需先在无水乙醇/甲醇中充分浸润 30s 以上激活,浸入转膜缓冲液平衡,操作时避免剧烈摩擦膜表面。
  2. 转膜缓冲液配制:
    • 方法一:电泳液800 mL+无水乙醇200 mL。
    • 方法二: X-R&T Buffer(50X)16 mL+无水乙醇200 mL+dd水定容到1 L。
  3. 三明治组装:按 “黑色夹板(负极) – 海绵 – 滤纸 3 张 – 凝胶 – 膜 – 滤纸 3 张 – 海绵 – 透明或红色夹板(正极)” 顺序组装,完全排出气泡,夹紧后放入湿转电转槽;避免使用变形夹板,确保使用试剂盒配套海绵和滤纸。(若进行了凝胶裁切需裁切膜的尺寸小于凝胶尺寸)
    • 2块胶转膜系统,严格按照试剂盒提供的 1片海绵+3张滤纸。
    • 4块胶转膜系统,严格按照试剂盒提供的 1片海绵+2张滤纸。
  4. 转膜条件:
    • 10–180kDa 蛋白:400mA 转 15min;
    • 200kDa 蛋白:400mA转20-25min;
    • <20kDa 蛋白:建议用X-即用NC膜。

03-4 转膜质检

本试剂盒不含X-UltraStain 蛋白染色液和免洗丽春红染色液,需额外采购。转膜后小心取出凝胶,放入 20 mL X-UltraStain 蛋白染色液中摇床染色 15 min观察是否有蛋白残留,或用 10-20 mL 免洗丽春红染色液对膜进行染色 1-2 min,倒掉染色液后用蒸馏水漂洗 2-3 次,直至出现清晰条带,拍照记录转膜效率。

注意事项：
  1. 用镊子轻夹膜的边角,避免手指或其他物品直接接触膜表面,防止污染或损伤。
  2. 膜的保存过程中避免弯折,远离锐利物品;转膜、抗原活化与激活过程中全程保持膜湿润。

03-5 内参/标签检测

此流程只针对内参抗体,转膜后,就无需内参一抗二抗孵育,无需封闭。如无需内参检测就按照常规流程进行下一步。

  1. 染色液预混准备:将内参孵育加速液瞬时离心后,按照加速液1 μL 、内参染色液1 mL比例,现配现用,轻摇混匀,不要斡旋混匀。
  2. 内参染色孵育:转膜完成后,将膜直接置入混合好的染色液中(2-5 mL),室温摇床染色 10–15 min。
  3. 膜漂洗:取 X-高效漂洗液(50X)10 mL,加 dd水定容至 500 mL,将膜转入漂洗液中,摇床漂洗5 min× 3 次。
  4. 显色曝光:按 1:1 等体积混合 X-ECL 超敏发光液 A 与 B,现配现用。吸干膜上多余漂洗液后,将膜双面充分浸润 ECL 工作液,进行曝光显色。
注意事项：
  1. 内参染色液可反复使用3-5次,使用后及时放回4℃保存。
  2. 操作全程请勿将膜直接与孵育盒接触,避免污染膜表面。

03-6 ECL显色

  1. 配置发光液:按等体积将 A 液与 B 液混合,现配现用;混合后的发光液直接倒入孵育盒中。
  2. 放入膜并均匀覆盖:将吸干表面水分的膜放入已加好发光液的孵育盒内,轻轻摇动,使发光液充分、均匀覆盖整张膜。
  3. 曝光检测:将膜转移至曝光保护膜中,放入化学发光仪进行曝光;若信号过强,可适当降低抗体浓度或减少上样量。
注意事项：
  1. X-ECL 超敏发光液需避免强光照射,使用后立即密封保存,以免灵敏度降低。
  2. A、B 液中偶有絮状物沉淀,属于稳定剂析出,不影响发光性能。
  3. 曝光保护膜请勿用尖锐物品或过多压力接触,以免破损,不建议反复使用。

03-7 Stripping（膜再利用）

本试剂盒不含X-Strip 高效剥离液,需额外采购

  1. 漂洗:将曝光后的膜放入容器中,加入 20 mL 去离子水(禁止使用 TBST),室温摇床漂洗 5 min。
  2. 剥离:弃去去离子水,加入 X-Strip 高效剥离液完全覆盖膜,室温摇床剥离 10 min;若蛋白表达量较高,可重复 1 次剥离步骤。
  3. 二次漂洗:再次加入 20 mL 去离子水,室温摇床漂洗 5 min。然后,重复前面抗原激活与抗体孵育操作。
注意事项：
  1. 若剥离前膜上出现棕色条带,是蛋白表达量过高或 ECL 发光液反应过度导致,建议降低上样量或调整曝光顺序。
  2. 建议优先孵育曝光丰度较低的蛋白,剥离后再孵育丰度较高的蛋白;洗脱效果受膜类型、抗体类型、浓度及抗原特性影响,需根据实际情况优化。

不同细胞量裂解液用量

按对应比例加入 X-RIPA UltraMix 预混裂解液

培养容器 细胞量 裂解液用量
6孔板(单孔) 1 × 10⁶ 200 μL
12孔板(单孔) 0.5 × 10⁶ 100 μL
24孔板(单孔) 0.2~0.3 × 10⁶ 50 μL
60 mm培养皿 2~3 × 10⁶ 400–500 μL
100 mm培养皿 8~10 × 10⁶ 1 mL
T25瓶 2~3 × 10⁶ 400–500 μL
T75瓶 8~10 × 10⁶ 1 mL

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