X-Blot · 艾克生命
1小时内参/标签蛋白
检测试剂盒
Western Blot 全流程 · 蛋白印迹 · 科研专用
Catalog # Xblot-X2 / Xblot-X3
产品概述
X-Flash WB All-in-One Kit 用于检测特定蛋白质表达丰度，流程包括蛋白提取、电泳分离、转膜、抗原活化与激活、洗膜、ECL 显色及膜再利用（选配）等步骤。
产品
| 产品 | 规格 | 储存温度 |
|---|---|---|
| X-RIPA UltraMix 预混裂解液 | 5 mL | -20℃ |
| X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液 | 2 mL (5X) | 常温储存 |
| X-Gel PreCast 预制胶 | 10 PE | 常温储存 |
| X-R&T Buffer 电泳/转膜通用缓冲液 | 100 mL (50X) | 常温储存 |
| 三明治套餐 | 滤纸12张+海绵4片 | 常温储存 |
| 内参/标签染色液 | 10 mL | -20℃ |
| X-高效漂洗液 | 10 mL | 常温储存 |
| X-ECL 超敏发光液(fg) | 10 mL | 常温储存 |
01蛋白提取+
1裂解操作：贴壁细胞 —— 去除培养液，用 PBS 轻柔润洗 2 次（贴壁不牢固的细胞，PBS 需缓慢沿壁滴入，避免冲掉细胞）。单个 6 孔板约 1×10⁶ 个细胞，加入 200 μL X-RIPA UltraMix（其他培养容器用量参照文末用量表）。
2悬浮细胞 —— 离心收集细胞，用 1×PBS 重悬、清洗，弃去 PBS。每 1×10⁶ 个细胞，加入 200 μL X-RIPA UltraMix 预混裂解液，吹打混匀；冰浴或 4℃ 静置 15 min。细菌样本需添加溶菌酶，酵母样本需添加蜗牛酶。
3组织样品 —— 用预冷生理盐水将切碎的组织漂洗 2–3 次，吸干多余液体；按每 20 mg 组织加入 200 μL X-RIPA UltraMix，钢珠研磨 3–5 min，冰上静置 10 min。（肠道、肝脏、脂肪等特殊组织请联系工作人员获得去油脂方案。）
4离心取上清：12000–14000g 冷冻离心 3–5 min，取上清 -80℃ 保存或立即变性；若样本仍含透明状粘稠物，加倍添加裂解液，反复吹打再次离心后取上清。
5样品变性：将上清与 X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液以 4:1 (5X) 比例室温混匀，95–100℃ 加热 5 min 变性，加热结束后瞬时离心，取样加入 SDS-PAGE 胶加样孔内。（膜蛋白请联系工作人员获得更优变性方案。）
1.本品裂解变性后样品可反复冻融，不适合 Bradford 法，推荐采用 BCA 法检测蛋白浓度；BCA 定量时需使用本裂解液稀释 BSA 制备标准曲线。
2.X-Loading 还原型蛋白上样缓冲液含变性剂及还原剂，不适用于 Native PAGE 胶电泳。
3.样品混合加热后管盖会出现较多冷凝水，务必瞬时离心。
4.X-Loading 常温存放即可；低温运输中凝固可 37℃ 水浴加热 5 min 恢复，若仍有粘稠物，可剪去枪头尖端吸取。
02电泳+
1缓冲液配制：取 20 mL X-R&T Buffer（50X），用 dd 水定容至 1 L；若配制后出现白色浑浊，建议更换超纯水或娃哈哈水。
2预制胶安装：取出 X-Gel PreCast 预制胶，撕掉底端棕色保护条 → 从两侧平行推出梳子 → 透光检查样品孔（若歪斜用枪头拨正）→ 加样孔朝内安装到电泳槽，确保内、外液面一致且没过加样孔，外槽液体不足则加填充物/补配缓冲液。
3上样与电泳：预留一到两个样品孔加入 2–3 μL 三色预染蛋白 Marker（用新枪头吸取，避免沾染电泳缓冲液污染），其余样品孔直接上样（避免枪头过度插入胶板）。恒压 300V 电泳 15 min 或 250V 电泳 20 min，Marker 分离达到理想状态即可停止电泳，无需依赖溴酚蓝位置。
4凝胶取出：用配套翘板工具，自上而下撬胶板两侧铆钉（禁止用普通切胶板），底端铆钉若撬不开可直接掰断 → 胶扣到浸润的三明治滤纸上可自动脱落。
1.三色预染蛋白 Marker 使用后需盖上管盖，放回 -20℃ 储存，防止降解。
2.电泳全程确保电泳槽水平放置。
03转膜（免冰浴）+
1膜的准备：X-即用 NC 膜（强烈推荐，效果优于传统 PVDF 膜）直接浸入提前制备的转膜缓冲液中平衡，弃去保护纸；X-即用 PVDF 膜需先在无水乙醇/甲醇中充分浸润 30s 以上激活，浸入转膜缓冲液平衡，操作时避免剧烈摩擦膜表面。
2转膜缓冲液配制：
| 膜类型 | 方法一 | 方法二 |
|---|---|---|
| NC 膜 | 电泳液 800 mL + 无水乙醇 200 mL | X-R&T Buffer(50X) 16 mL + 无水乙醇 200 mL + dd水定容到 1 L |
| PVDF 膜 | 电泳液 700 mL + 无水乙醇 300 mL | X-R&T Buffer(50X) 14 mL + 无水乙醇 300 mL + dd水定容到 1 L |
3三明治组装：按「黑色夹板（负极）- 海绵 – 滤纸3张 – 凝胶 – 膜 – 滤纸3张 – 海绵 – 透明或红色夹板（正极）」顺序组装，完全排出气泡，夹紧后放入湿转电转槽；避免使用变形夹板，确保使用试剂盒配套海绵和滤纸（若进行凝胶裁切，需裁切膜的尺寸小于凝胶尺寸）。2块胶转膜系统：1片海绵+3张滤纸；4块胶转膜系统：1片海绵+2张滤纸。
4转膜条件：10–180kDa 蛋白：400mA 转 15 min；＞200kDa 蛋白：400mA 转 20–25 min；＜20kDa 蛋白：建议用 X-即用 NC 膜。
04转膜质检+
1转膜后小心取出凝胶，放入 20 mL X-UltraStain 蛋白染色液中摇床染色 15 min，观察是否有蛋白残留；或用 10–20 mL 免洗丽春红染色液对膜染色 1–2 min。
2倒掉染色液后用蒸馏水漂洗 2–3 次，直至出现清晰条带，拍照记录转膜效率。
提示本试剂盒不含 X-UltraStain 蛋白染色液和免洗丽春红染色液，需额外采购。
1.用镊子轻夹膜的边角，避免手指或其他物品直接接触膜表面，防止污染或损伤。
2.膜的保存过程中避免弯折，远离锐利物品；转膜、抗原活化与激活过程中全程保持膜湿润。
05内参/标签检测+
1染色液预混准备：使用前，将染色液与孵育加速液按照 100:1 混合，轻摇混匀，预混液保存于 4℃，勿置于 -20℃。
2染色孵育：转膜完成后，将预混液恢复至室温，根据膜的大小取 2–5 mL 预混液，将膜放入预混液中，以膜可完全漂浮为准，室温摇床孵育 10–15 min。
3膜漂洗：将膜转入 TBST（或 X-高效漂洗液），室温摇床漂洗 5 min × 3 次。
4显色曝光：按 1:1 等体积混合 X-ECL 超敏发光液 A 与 B，现配现用。吸干膜上多余漂洗液后，将膜双面充分浸润 ECL 工作液，进行曝光显色。
1.染色液和加速液混合之后微微发红，属于正常现象，不影响实验结果。
2.预混液可反复使用 3-5 次，使用后及时放回 4℃ 保存。
3.操作全程请勿将膜直接与孵育盒接触，避免污染膜表面。
4.仅限用于哺乳动物样品，不可用于植物样品。
06ECL 显色+
1配置发光液：按等体积将 A 液与 B 液混合，现配现用；混合后的发光液直接倒入孵育盒中。
2放入膜并均匀覆盖：将吸干表面水分的膜放入已加好发光液的孵育盒内，轻轻摇动，使发光液充分、均匀覆盖整张膜。
3曝光检测：将膜转移至曝光保护膜中，放入化学发光仪进行曝光；若信号过强，可适当降低抗体浓度或减少上样量。
1.X-ECL 超敏发光液需避免强光照射，使用后立即密封保存，以免灵敏度降低。
2.A、B 液中偶有絮状物沉淀，属于稳定剂析出，不影响发光性能。
3.曝光保护膜请勿用尖锐物品或过多压力接触，以免破损，不建议反复使用。
07膜再利用（Stripping）+
1漂洗：将曝光后的膜放入容器中，加入 20 mL 去离子水（禁止使用 TBST），室温摇床漂洗 5 min。
2剥离：弃去去离子水，加入 X-Strip 高效剥离液完全覆盖膜，室温摇床剥离 10 min；若蛋白表达量较高，可重复 1 次剥离步骤。
3二次漂洗：再次加入 20 mL 去离子水，室温摇床漂洗 5 min。然后重复前面 03-6 抗原激活与抗体孵育。
提示本试剂盒不含 X-Strip 高效剥离液，需额外采购。
1.若剥离前膜上出现棕色条带，是蛋白表达量过高或 ECL 发光液反应过度导致，建议降低上样量或调整曝光顺序。
2.建议优先孵育曝光丰度较低的蛋白，剥离后再孵育丰度较高的蛋白；洗脱效果受膜类型、抗体类型、浓度及抗原特性影响，需根据实际情况优化。
不同细胞量裂解液用量
按对应比例加入 X-RIPA UltraMix 预混裂解液
| 培养容器 | 细胞量（个） | 推荐裂解液体积 |
|---|---|---|
| 6孔板（单孔） | 1 × 10⁶ | 200 μL |
| 12孔板（单孔） | 0.5 × 10⁶ | 100 μL |
| 24孔板（单孔） | 0.2~0.3 × 10⁶ | 50 μL |
| 60 mm 培养皿 | 2~3 × 10⁶ | 400–500 μL |
| 100 mm 培养皿 | 8~10 × 10⁶ | 1 mL |
| T25 瓶 | 2~3 × 10⁶ | 400–500 μL |
| T75 瓶 | 8~10 × 10⁶ | 1 mL |
